John Hopkins wurde in Luton geboren und studierte von 1993 bis 1996 Englisch an der University of Leeds. Als Student trat er der Theatergruppe der Universität bei und wirkte in mehreren Stücken mit, wobei er schließlich für seine Darstellung in "A Short Play About Sex and Death" den Studenten-Schauspielpreis der "Sunday Times" gewann. Mit diesen gestärkten schauspielerischen Referenzen wurde John an der Londoner Royal Academy of Dramatic Arts aufgenommen, die er im Jahr 2000 abschloss. Fast unmittelbar danach wurde er von der renommierten Royal Shakespeare Company engagiert, mit der er von 2001 bis 2002 seine erste Repertoiresaison spielte. Etwa zu dieser Zeit brachten ihm sein Aussehen Fernsehangebote ein, und nach kleineren Rollen in "Love in a Cold Climate" und "Trial and Retribution 7" wurde ihm die Rolle angeboten, für die er bei Nicht-Theaterbesuchern am bekanntesten ist, und er nahm sie an: als Sergeant Scott in der zunehmend bemühten, aber populären britischen Krimiserie Midsomer Murders (1997).

Ihm gebührt Anerkennung: Er verließ die Serie nach der Saison 2004–2005 und kehrte für die Saison 2006–2007 zur Royal Shakespeare Company zurück, sowohl in London als auch in Stratford-upon-Avon, wo er an der Seite von Patrick Stewart in 'Antony and Cleopatra' den Caesar spielte. In jüngerer Zeit umfassten seine Bühnenrollen Richard Hannay in Patrick Barlows komödiantischer Vier-Personen-Version von 'The 39 Steps', Richard I. in dem neuen Stück 'Holy Warriors' am Shakespeare's Globe und Benedick in 'Much Ado About Nothing', eine Darbietung, von der The Guardian sagte, sie "bestätige Hopkins als einen unserer besten Shakespeare-Schauspieler". Zurück im Fernsehen war er ein Bösewicht in 'Stan Lee's Lucky Man' und spielte Sir Francis Basset in zwei Staffeln des BBC-Dramas 'Poldark'. In einem Artikel der Times (London) aus dem Jahr 2020 wurde er zu einem der '10 besten britischen Schauspieler, die derzeit auf der Bühne stehen' gekürt.