Джон Хопкинс родился в Лутоне и с 1993 по 1996 год изучал английский язык в Университете Лидса. Будучи студентом, он присоединился к университетской драматической группе и появился в нескольких пьесах, в итоге получив награду «Sunday Times» как студент-актёр за выступление в «Короткой пьесе о сексе и смерти». Укрепив таким образом свои актёрские данные, Джон был принят в Лондонскую Королевскую академию драматического искусства, которую окончил в 2000 году. Почти сразу его пригласила престижная Королевская шекспировская компания, с которой он отыграл свой первый репертуарный сезон с 2001 по 2002 год. Примерно в это время его внешность способствовала телевизионным предложениям, и после второстепенных ролей в «Любви в холодном климате» и «Суде и возмездии 7» ему предложили и он принял роль, по которой он наиболее известен зрителям, не ходящим в театр, — сержанта Скотта в становившемся всё более натужным, но популярном британском детективном телесериале «Убийства в Мидсомере» (1997).

Отдадим ему должное: он покинул шоу после сезона 2004–2005 годов и вернулся в Королевскую шекспировскую компанию на сезон 2006–2007 годов как в Лондоне, так и в Стратфорде-на-Эйвоне, сыграв Цезаря напротив Патрика Стюарта в «Антонии и Клеопатре». В последнее время его сценические роли включали Ричарда Ханнея в комедийной версии «39 ступеней» Патрика Барлоу для четырёх актёров, Ричарда I в новой пьесе «Святые воины» в театре «Глобус» Шекспира и Бенедика в «Много шума из ничего», выступление, о котором The Guardian сказала: «подтверждает Хопкинса как одного из наших лучших шекспировских актёров». Вернувшись на телевидение, он был злодеем в «Счастливчике Стэна Ли» и сыграл сэра Фрэнсиса Бассета в двух сезонах драмы BBC «Полдарк». В статье 2020 года в The Times (Лондон) он был назван одним из «10 лучших британских актёров на сцене сейчас».