John Hopkins est né à Luton et a étudié l'anglais à l'Université de Leeds de 1993 à 1996. En tant qu'étudiant, il a rejoint le groupe de théâtre de l'université et est apparu dans plusieurs pièces, remportant finalement le prix du meilleur acteur étudiant du « Sunday Times » pour sa performance dans « A Short Play About Sex and Death ». Fort de ces références théâtrales, John a été admis à la Royal Academy of Dramatic Art de Londres, dont il est diplômé en 2000. Presque immédiatement, il a été recruté par la prestigieuse Royal Shakespeare Company, avec laquelle il a joué sa première saison de répertoire, de 2001 à 2002. À cette époque, son physique lui a valu des offres télévisées et, après des rôles mineurs dans « Love in a Cold Climate » et « Trial and Retribution 7 », on lui a proposé et il a accepté le rôle pour lequel il est le plus connu du public non théâtral, celui du sergent Scott dans la série télévisée britannique de plus en plus laborieuse mais populaire Midsomer Murders (1997).

Il faut lui rendre justice : il a quitté la série après la saison 2004-2005 et est revenu à la Royal Shakespeare Company pour sa saison 2006-2007, à Londres et à Stratford-upon-Avon, jouant César face à Patrick Stewart dans « Antoine et Cléopâtre ». Plus récemment, ses rôles sur scène ont inclus Richard Hannay dans la version comique à quatre personnages de Patrick Barlow, « The 39 Steps », Richard Ier dans la nouvelle pièce « Holy Warriors » au Shakespeare's Globe, et Benedick dans « Much Ado About Nothing », une performance que The Guardian a qualifiée de « confirme Hopkins comme l'un de nos meilleurs acteurs shakespeariens ». De retour à la télévision, il a été un méchant dans « Stan Lee's Lucky Man », et a joué Sir Francis Basset pendant deux saisons du drame de la BBC « Poldark ». Dans un article de 2020 du Times (Londres), il a été nommé parmi les « 10 des meilleurs acteurs britanniques actuellement sur scène ».