Iouri Nikouline est né dans la ville de Demidov. Ses parents, Vladimir Andreïevitch et Lidia Ivanovna Nikouline, travaillaient au théâtre dramatique local. Quatre ans après la naissance de Iouri, la famille Nikouline s'installa à Moscou. Son père écrivait des miniatures et des reprises de cirque et travailla quelque temps comme correspondant pour les journaux « Izvestia » et « Goudok ». Pendant ses études à l'école, le futur acteur fréquenta un cercle dramatique au sein de la Maison d'éducation artistique des enfants. Après l'obtention de son diplôme, Nikouline fut appelé sous les drapeaux. Le futur artiste traversa deux guerres : la guerre finlandaise et la Grande Guerre patriotique. Il combattit près de Leningrad et fut commotionné. En 1946, Iouri fut démobilisé avec le grade de sergent-chef. De retour du front, Nikouline décida de devenir acteur et déposa sa candidature au VGIK, mais ne fut pas admis. Il se présenta ensuite aux examens d'entrée de l'École de théâtre Chtchepkine, tenta également d'entrer au GITIS et dans d'autres établissements d'enseignement théâtral moscovites, mais fut partout refusé en raison de « l'absence de capacités d'acteur et de données physiques appropriées ». Finalement, Iouri entra au studio de genre parlé du cirque de Moscou, après quoi il devint en 1949 artiste de cirque (clown). Nikouline commença à travailler au cirque de Moscou comme assistant du célèbre clown Karandach (Mikhaïl Nikolaïevitch Roumiantsev), avec qui il collabora environ trois ans. Dans la troupe de Karandach, il fit la connaissance de l'acrobate Mikhaïl Chouïdine et, à partir de 1950, travailla en duo avec lui. Cette union créative dura longtemps et connut un grand succès auprès du public. Iouri Nikouline créa sur la piste de nombreuses reprises, saynètes et pantomimes inimitables, dont les plus célèbres sont : « Le Petit Pierre », « Pipo et le millionnaire » dans les spectacles « Carnaval à Cuba » et « La Pipe de la paix », Barmaleï dans le spectacle pour enfants du Nouvel An, etc.

En 1958, l'artiste débuta au cinéma en jouant un petit rôle de pyrotechnicien dans le film « La Jeune Fille à la guitare ». L'amour du peuple vint à Iouri Nikouline après le rôle de Balbès dans les comédies « Le Chien Barbos et la course insolite » (1961), « Les Distillateurs » (1961), « Opération « Y » et autres aventures de Chourik » (1965) et « La Prisonnière du Caucase, ou les Nouvelles Aventures de Chourik » (1967). L'artiste tourna également dans des films populaires tels que : « Les Indomptables » (1959), « L'Homme de nulle part » (1961), « Quand les arbres étaient grands » (1961), « La Mégère apprivoisée » (1961), « Mon ami, Kolka !.. » (1961), « Les Gens d'affaires » (1962), « Jeunesse verte » (1962), « Sans peur et sans reproche » (1963), « Viens à moi, Moukhtar ! » (1964), « Donnez le livre de réclamations » (1965), « Les Rêveurs » (1965), « Le Petit Fugitif » (1965), « Andreï Roublev » (1966), « La Prisonnière du Caucase, ou les Nouvelles Aventures de Chourik » (1966), « Sept vieillards et une jeune fille » (1968), « Le Bras de diamant » (1968), « La Nouvelle » (1968), « Les Vieux Bandits » (1971), « Le Télégramme » (1971), « Douze chaises » (1971), « Point, point, virgule… » (1972), « Ils se battaient pour la patrie » (1975), « 20 jours sans guerre » (1976), « Les Aventures de Travka » (1976), « Par ici… pas loin » (1979), « Je ne veux pas être adulte » (1982), « L'Épouvantail » (1983), « Le Capitaine Crocus » (1991), etc.